一、化学法siRNA合成中氧化步骤的核心作用

    化学法合成siRNA通常采用固相亚磷酰胺法，其核心是通过逐步连接核苷酸单体（亚磷酰胺）形成磷酸二酯键，而氧化步骤是核苷酸链延伸过程中的关键环节，直接决定了核苷酸之间连接键的化学稳定性。具体作用如下：

1. 将 “不稳定中间体” 转化为 “稳定连接键”

    亚磷酰胺单体与固相载体上的核苷酸链偶联后，形成的是亚磷酸三酯中间体（P (III) 价态），这种结构极不稳定，易被水解、氧化或降解，无法支撑长链核苷酸的合成，也不能满足 siRNA 后续的生物学应用需求。

    氧化步骤的核心功能是利用氧化剂（常用碘/水/吡啶体系，或叔丁基过氧化氢等）将亚磷酸三酯中的P (III) 氧化为磷酸三酯（P (V) 价态）—— 这是核苷酸链中天然存在的稳定连接形式，能有效抵抗水解和降解，为 siRNA 的一级结构（核苷酸序列）提供稳定骨架。

 

2. 确保siRNA链的正确延伸与纯度

    氧化反应的效率直接影响每一步核苷酸偶联的 “有效性”：只有氧化完全，才能形成稳定的磷酸三酯键，确保下一个亚磷酰胺单体能够顺利偶联；若氧化不完全，未转化的亚磷酸三酯中间体可能在后续的脱保护、洗涤步骤中降解，导致 “链终止” 或产生截短的杂质片段，降低最终siRNA的纯度。

二、氧化不完全对siRNA稳定性的具体影响

    氧化不完全会导致 siRNA 分子中残留未氧化的亚磷酸三酯键或部分氧化的杂质，这些缺陷会从 “化学稳定性”“生物学稳定性” 和 “功能活性” 三个层面破坏 siRNA 的性能，具体如下：

1. 化学稳定性显著下降：易水解、降解

    亚磷酸三酯（P (III)）的化学惰性远低于磷酸三酯（P (V)），对水、酸、碱等环境极其敏感：

    在合成后的脱保护步骤（如用氨水处理去除碱基和磷酸基团上的保护基）中，未氧化的亚磷酸三酯键会迅速水解断裂，导致siRNA链发生 “截短”（形成短于 21-23nt的片段），甚至完全降解；

    在后续的储存或溶解过程中，残留的亚磷酸三酯键易被空气中的氧气、溶液中的微量金属离子或酶催化降解，导致 siRNA 浓度降低、纯度下降，无法长期保存。

 

2. 生物学稳定性受损：易被核酸酶识别降解

    siRNA进入细胞后，需要抵抗细胞内核酸酶（如核酸外切酶、内切酶） 的降解才能发挥RNA干扰（RNAi）作用。氧化不完全的 siRNA 存在以下缺陷：

    未氧化的亚磷酸三酯键会改变siRNA骨架的电荷分布和空间构象，使其更容易被核酸酶识别为 “异常核酸链”，从而被优先降解；

    截短的siRNA片段（氧化不完全导致的链断裂产物）不仅失去干扰活性，还可能被细胞内的降解系统快速清除，进一步降低有效 siRNA 的浓度。

 

3. 功能活性降低：干扰效率下降

    siRNA的功能依赖于其完整的双链结构（21-23nt，3’端含 2 个突出碱基）与 Argonaute（Ago）蛋白形成 RNA 诱导沉默复合体（RISC）。氧化不完全的影响包括：

    截短的siRNA片段无法正确结合Ago蛋白，导致RISC形成效率下降；

    残留的亚磷酸三酯键可能影响siRNA与靶 mRNA 的碱基配对亲和力，降低靶 mRNA 的切割效率；

    降解产生的单链RNA片段可能引发非特异性免疫反应（如激活TLR3/TLR7），干扰细胞正常生理过程，进一步削弱 RNAi 效果。

 

    氧化步骤是化学法 siRNA合成中 “从不稳定中间体到稳定磷酸二酯键” 的关键转化环节，直接决定siRNA的化学完整性和纯度。氧化不完全会通过增加水解敏感性、降低核酸酶抗性、破坏功能结构三个途径，显著削弱siRNA的稳定性和RNA干扰活性，因此合成中需严格控制氧化剂浓度、反应时间和温度，确保氧化完全。