EMSA核心原理及 “跑不动” 的原因解析

    EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay，电泳迁移率变动分析）是分子生物学中用于检测蛋白质与核酸（DNA/RNA）相互作用的经典技术，其核心逻辑围绕 “电泳迁移率差异” 展开，结合蛋白质的核酸 “跑不动” 本质是分子大小、电荷性质改变导致的迁移速度变化。

一、EMSA 的核心原理

EMSA核心是利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE） 分离核酸分子，通过对比 “游离核酸” 与 “蛋白质 - 核酸复合物” 的电泳迁移位置，判断二者是否结合。具体可拆解为3个关键步骤和底层逻辑：

1. 实验设计的核心前提：非变性电泳环境

    与变性电泳（如 SDS-PAGE，会破坏蛋白质结构和复合物）不同，EMSA 使用非变性凝胶缓冲体系（不添加 SDS、β- 巯基乙醇等变性剂），目的是：

    保持蛋白质的天然空间结构（确保其能与核酸正常结合）；
    维持 “蛋白质 - 核酸复合物” 的稳定性（避免复合物解离，影响后续分离）。

2. 核心现象：迁移率差异的产生

    实验中会设置两个关键组，通过电泳后的信号（如核酸标记的荧光/放射性）对比，观察相互作用：

    游离核酸组：仅含标记的靶核酸（如特定启动子区域的 DNA 片段），无蛋白质；

    蛋白质-核酸孵育组：靶核酸与待检测蛋白质（如转录因子、酶）预先孵育，若二者结合则形成 “蛋白质 - 核酸复合物”。

    电泳时，凝胶作为多孔分子筛，分子的迁移速度由两个核心因素决定：分子大小（ Stokes 半径） 和净电荷量。当核酸结合蛋白质后，这两个因素均发生改变，最终导致迁移率显著降低（即 “跑不动”）。

3. 结果验证：特异性对照的必要性

    为排除非特异性结合（如蛋白质与核酸的随机吸附），需设置对照实验（如 “竞争实验”：加入过量未标记的相同核酸，若能竞争性取代标记核酸，说明结合是特异性的），这是 EMSA 结果可信性的关键，也是其原理的延伸应用。

 

二、为什么结合蛋白质的核酸会 “跑不动”？

    结合蛋白质的核酸 “跑不动”，本质是 “蛋白质 - 核酸复合物” 与 “游离核酸” 在分子大小和电荷性质上的巨大差异，导致电泳迁移速度显著减慢，具体原因可从以下2点详细解释：

1. 分子大小剧增：凝胶分子筛的 “阻碍效应”

    非变性凝胶的多孔结构类似 “分子筛”，分子在电场中迁移时，需穿过凝胶的微孔，分子越大（Stokes 半径越大），受到的微孔阻碍越强，迁移速度越慢。

    游离核酸（如短链 DNA 探针）：分子质量小（通常几十至几百 bp，约几万 Da），Stokes 半径小，能快速穿过凝胶微孔，电泳后会迁移到凝胶的较下方位置；

    蛋白质-核酸复合物：蛋白质分子质量远大于核酸（如一个转录因子约 20-100kDa，若形成二聚体则更大），结合后复合物的总分子质量和 Stokes 半径会 “倍增”（如 “20kDa 蛋白质 + 10kDa DNA” 的复合物，大小远超过单独的 10kDa DNA）。

    这种 “体积膨胀” 会使复合物在凝胶中受到更强的摩擦阻力和微孔阻碍，迁移速度大幅下降，最终停留在凝胶的较上方位置，形成 “跑不动” 的视觉效果。

2. 净电荷量改变：电场驱动力的 “削弱效应”

    核酸（DNA/RNA）本身带有强烈的负电荷（磷酸骨架贡献），在电场中会向正极快速迁移，这是其电泳迁移的核心驱动力；而蛋白质的净电荷则因氨基酸组成（如酸性氨基酸带负电、碱性氨基酸带正电）不同，可能为负、正或中性。
当蛋白质与核酸结合时，会发生以下电荷变化：

    若蛋白质带正电：会中和部分核酸的负电荷，导致复合物的净负电荷量减少，向正极的迁移驱动力减弱；

    若蛋白质带负电：虽不会中和核酸电荷，但复合物的总负电荷量虽增加，但其 “分子大小增加的幅度” 远超过 “电荷增加的幅度”—— 根据电泳迁移率公式（迁移率∝电荷/分子大小），分子大小对迁移率的影响占主导，最终仍导致迁移速度下降。

    蛋白质的结合要么 “削弱驱动力（中和电荷）”，要么 “放大阻碍（增大体积）”，二者共同作用使复合物迁移速度远慢于游离核酸，表现为 “跑不动”。

 

    EMSA 的核心原理是利用非变性电泳分离 “游离核酸” 与 “蛋白质 - 核酸复合物”，通过迁移位置差异判断相互作用；而结合蛋白质的核酸 “跑不动”，本质是 “复合物分子大小剧增（分子筛阻碍增强）” 和 “净电荷量改变（电场驱动力减弱）” 的双重作用，导致其电泳迁移率显著低于游离核酸。这一技术至今仍是研究转录调控、酶 - 核酸互作等领域的重要工具。