利用生物信息学预测蛋白质与DNA的相互作用位点，再通过酵母单杂交实验验证，是研究转录调控（如转录因子 - 启动子结合）的经典思路。该流程的核心逻辑是：先通过生物信息学缩小候选结合位点范围，再用实验验证相互作用的真实性，具体可分为 “生物信息学预测” 和 “酵母单杂交验证” 两大模块，以下详细解析各步骤及关键注意事项：

一、生物信息学预测蛋白质-DNA相互作用位点

    蛋白质与 DNA的相互作用依赖于蛋白质的 DNA结合结构域（DBD） 与DNA上的顺式作用元件（如转录因子结合位点 TFBS） 的特异性结合，预测需从 “蛋白质DBD分析” 和 “DNA候选区域位点预测” 两方面入手，结合多工具交叉验证提高准确性。

（1）第一步：分析目标蛋白质的DNA结合结构域（DBD）——明确 “结合能力基础”

    首先需确认目标蛋白质是否含已知的 DNA结合结构域（如锌指、螺旋 - 环 - 螺旋 HLH、亮氨酸拉链bZIP等），这是判断其是否能结合 DNA的前提。

 

（2）第二步：确定DNA候选区域 —— 锁定 “潜在结合片段”

    蛋白质（如转录因子）通常结合于目标基因的启动子区域（转录起始位点 TSS 上游2000bp 至下游500bp）或增强子沉默子区域，需先获取该区域的DNA序列。

 

（3）第三步：预测具体的DNA结合位点——定位 “核心结合序列”

    基于上述DBD 和 DNA候选区域，用工具预测具体的结合位点（通常为 6-15 bp 的短序列，即 “模体 Motif”），常用两种策略：

策略 1：基于 “已知模体（PWM）” 的预测 —— 适合有已知DBD 家族的蛋白质

    若目标蛋白质属于已知转录因子家族（如 bZIP、NF-κB），可利用数据库中收录的该家族蛋白质的位置权重矩阵（PWM） ，在 DNA候选区域中搜索匹配的模体。

策略 2：基于 “蛋白质结构” 的对接预测——适合有三维结构的蛋白质

    若目标蛋白质（或其DBD）有已知三维结构（如PDB数据库中可查），可通过分子对接模拟蛋白质与DNA的结合，预测关键结合位点及相互作用的氨基酸核苷酸。

（4）预测结果的筛选原则

    为减少后续实验工作量，需按以下标准筛选候选位点（通常保留3-5个）：

    显著性优先：FIMO预测的p值<1e-4，或对接结合能<-5kcal/mol；
    位置相关性：优先选择启动子核心区（TSS 上游200-1000bp）或表观活性区域的位点；

二、酵母单杂交实验验证 —— 确认 “真实相互作用”

    酵母单杂交（Yeast One-Hybrid, Y1H）的原理是：将目标蛋白质与酵母转录激活域（AD，如GAL4 AD）融合，若蛋白质能结合报告载体上的 DNA候选位点，则 AD 会激活下游报告基因（如 His3、LacZ）的表达，酵母可在选择性培养基上生长或显色。实验需分 “载体构建”“酵母转化与筛选”“阳性验证” 三步进行。

（1）第一步：构建核心载体（关键前提）

    需构建两类载体：AD-蛋白质融合载体（激活载体） 和DNA候选位点 - 报告基因载体（诱饵载体） ，载体需与酵母菌株的营养缺陷型匹配（如常用菌株 Y187 为 Trp⁻、Leu⁻，载体需含 TRP1、LEU2 筛选标记）。

载体类型	构建要点	示例（以载体pGADT7-Rec2（AD载体，Leu⁻筛选） 和pHis2（报告载体，Trp⁻筛选）为例）
1. AD-蛋白质融合载体	目的基因克隆：从cDNA中PCR扩增目标蛋白质的编码序列（含完整DBD），引入与 pGADT7-Rec2多克隆位点匹配的酶切位点（如 EcoRⅠ、BamHⅠ）； 载体酶切与连接：用限制性内切酶双酶切AD载体和PCR产物，胶回收后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌 DH5α，筛选阳性克隆； 验证：通过菌落PCR、酶切验证和测序，确保目的基因正确插入AD载体（阅读框无移码，无碱基突变）。	扩增TP53的编码序列（含DBD）， 用EcoRⅠ/BamHⅠ 双酶切后连接到 pGADT7-Rec2 的对应位点， 构建 pGADT7-TP53 载体。
2. DNA候选位点-报告载体	诱饵DNA片段设计：合成3-5个串联的DNA候选位点（如每个位点10bp，串联3次，增强结合信号），两端引入与 pHis2 多克隆位点匹配的酶切位点（如HindⅢ、BglⅡ）； 载体构建与验证：双酶切pHis2载体和合成的诱饵DNA片段，连接后转化大肠杆菌，筛选阳性克隆； 阴性对照载体：构建含 “随机DNA序列”（与候选位点无同源性）的 pHis2载体，用于排除非特异性结合。	合成3个串联的 TP53 候选位点 “GGGCAAGCCC”， 用 HindⅢ/BglⅡ 连接到 pHis2 的报告基因（His3）上游，构建 pHis2-TP53-site 载体； 同时构建含随机序列的 pHis2-random 载体。

（2）第二步：酵母转化与选择性筛选

    将 AD 融合载体和报告载体共转化到酵母菌株（如 Y187），通过选择性培养基筛选能生长的酵母克隆（提示蛋白质与 DNA结合，激活报告基因）。

操作步骤	关键细节	对照设置（确保实验可靠性）
1. 酵母感受态制备	挑取Y187单菌落接种 YPD 液体培养基，30℃、200 rpm振荡培养至 OD₆₀₀=0.4-0.6（对数中期）； 按PEG/LiAc 法制备感受态细胞（参考酵母双杂交转化方法，确保细胞活性）。	无特殊对照，需确保感受态细胞转化效率正常 （可用空载体验证，菌落数 > 100 个平板）。
2. 共转化与涂布	共转化体系：AD载体（100ng）+ 报告载体（100ng）+ 酵母感受态（50μL），按PEG/LiAc 法操作，42℃热休克 25分钟，复苏后涂布筛选平板； 筛选平板选择： 基础筛选：SD-Leu-Trp 平板（仅筛选成功转化两种载体的酵母，排除未转化细胞）； 互作筛选：SD-Leu-Trp-His平板（加入3-AT，即3 -氨基 - 1,2,4 - 三唑，抑制 His3 基因的背景表达，浓度需优化：通常 0.5-50 mM，从低浓度开始测试）。	必须设置的对照： 1. 阳性对照：AD-已知结合蛋白+对应报告载体 （如 AD-GAL4+pHis2-GAL4-site，确保体系有效）；   2. 阴性对照 1：AD-空载体 + 报告载体 （排除报告载体自身激活）；   3. 阴性对照 2：AD-目标蛋白质 + pHis2-random （排除蛋白质与随机 DNA的非特异性结合）；   4. 空白对照：仅转化一种载体（排除污染）。
3. 培养与观察	30℃倒置培养3-5天，观察平板上是否有酵母克隆生长； 判断标准：若 AD-目标蛋白质+报告载体的平板上有克隆生长，且阴性对照平板（尤其是对照 2）无克隆或极少克隆，提示可能存在特异性相互作用。	若阳性对照生长正常，阴性对照1/2无生长，说明实验体系可靠； 若阴性对照2有生长，需提高3-AT浓度或重新筛选候选位点。

 

（3）第三步：阳性克隆的验证——排除假阳性

    筛选出的阳性克隆需进一步验证，确保相互作用的特异性，常用两种方法：

    β-半乳糖苷酶活性检测（X-Gal显色实验）

        原理：若蛋白质与DNA结合，除激活His3外，还会激活LacZ报告基因（部分载体如pLacZ含该基因），LacZ编码的β-半乳糖苷酶可分解X-Gal产生蓝色产物。

        操作：挑取阳性克隆接种SD-Leu-Trp-His液体培养基，30℃培养至 OD₆₀₀=0.5-1.0，取100μL 菌液加入X-Gal（终浓度40μg/mL），30℃孵育 8-24 小时，观察是否变蓝。

        判断：蓝色克隆为阳性（进一步确认相互作用），白色克隆为假阳性。
    点板验证与浓度梯度测试

        挑取阳性克隆，用无菌水稀释至 OD₆₀₀=0.1、0.01、0.001 三个浓度，分别点种到含不同 3-AT 浓度（如 1 mM、5 mM、10 mM）的 SD-Leu-Trp-His 平板上，30℃培养3天。

        判断：若克隆在高 3-AT 浓度下仍能生长（且阴性对照不能），说明相互作用强度高，特异性好。

    突变验证（可选，深入验证关键位点）

        对蛋白质的DBD 关键氨基酸（如预测的Arg→Ala突变）或DNA候选位点的关键核苷酸（如G→A突变）进行定点突变，构建突变型AD载体或报告载体。

        若突变后酵母无法在SD-Leu-Trp-His平板上生长，说明该氨基酸核苷酸是相互作用的关键位点，进一步证明相互作用的特异性。

 

三、关键注意事项（避免实验失败或假阳性）

    载体构建的阅读框检查：AD-蛋白质融合载体需确保目的基因的阅读框与AD的阅读框一致，否则无法表达正确的融合蛋白（可用在线工具如 “ExPASy Translate” 验证）。

    3-AT 浓度优化：不同报告载体的背景表达不同，需通过预实验测试3-AT浓度（从0.5mM开始，逐步提高），确保阴性对照无生长，阳性对照能生长。

    自身激活排除：若AD-空载体+报告载体的平板上有克隆生长（自身激活），需缩短DNA候选位点的长度、减少串联次数，或更换报告载体（如pLacZ替代 pHis2）。

    生物信息学预测的交叉验证：至少用两种不同工具（如JASPAR+FIMO和分子对接）预测候选位点，避免单一工具的假阳性结果。

 

四、流程总结

    预测阶段：分析蛋白质DBD→获取 DNA候选区域（启动子）→用 PWM 或分子对接预测结合位点→筛选 3-5个高置信度位点；

    实验阶段：构建 AD-蛋白质载体和 DNA- 报告载体→共转化酵母→选择性培养基筛选→β- 半乳糖苷酶活性验证→突变验证关键位点；

    结果判断：仅当 “AD-目标蛋白质 + 特异性报告载体” 的平板上有克隆生长且显色，而所有阴性对照无生长时，可确认蛋白质与该DNA位点存在特异性相互作用。

    该流程通过 “生物信息学缩小范围 + 实验验证确认” 的模式，高效且准确地研究蛋白质-DNA相互作用，是转录调控机制研究的核心方法之一。