外泌体鉴定是确保其研究或应用可靠性的关键步骤，需从形态特征、粒径分布、特异性标志物三个核心维度展开，这也是国际通用的外泌体鉴定 “金标准”（基于 MISEV 2018/2022 指南，即《最小信息规范：胞外囊泡研究》）。此外，部分场景还需补充纯度分析（排除杂质干扰），以下详细解析各指标及检测方法：

一、核心鉴定指标（三大维度）

    外泌体是源于细胞内体系统的胞外囊泡（EVs），直径约30-150nm，具有双层膜结构，且携带细胞来源的特异性蛋白、脂质和核酸，其鉴定需精准匹配这些特征。

1. 形态特征：双层膜囊泡结构（直观证据）

    外泌体的核心形态学特征是“杯状或茶碟状的双层磷脂膜囊泡”（因样本制备过程中脱水导致膜结构塌陷，而非天然形态），需通过高分辨率显微技术观察，排除其他非囊泡杂质（如蛋白质聚集体、脂蛋白颗粒）。

检测方法	原理与特点	关键判断标准
透射电子显微镜（TEM）	利用电子束穿透样本，获得高分辨率（0.1-1 nm）的黑白图像，是外泌体形态鉴定的 “首选方法”。	观察到明确的双层膜结构； 囊泡呈圆形/椭圆形，无明显棱角或不规则边缘； 排除 “无膜结构的颗粒”（如蛋白聚集体）或 “单层膜囊泡”（如微囊泡）。
冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）	样本在冷冻状态下直接观察，无需脱水染色，可保留外泌体天然形态（避免 TEM 导致的膜塌陷）。	天然状态下为球形双层膜囊泡； 膜结构完整，无人工损伤（如染色剂沉淀附着）。
扫描电子显微镜（SEM）	利用电子束扫描样本表面，获得三维表面图像，适合观察外泌体的分布和表面形态。	囊泡呈分散或聚集的球形颗粒； 表面光滑，无明显突起或杂质吸附。

2. 粒径分布：30-150 nm 的特征范围（尺寸证据）

    外泌体的粒径是区分其他胞外囊泡（如微囊泡：100-1000nm，凋亡小体：500-2000nm）的关键指标，需通过精准的粒径分析技术验证其尺寸符合典型范围，且分布集中（避免杂质导致的多峰分布）。

检测方法	原理与特点	关键判断标准
纳米颗粒跟踪分析（NTA）	基于激光散射原理，实时追踪单个囊泡的布朗运动，同时计算粒径分布和浓度（颗粒数 /mL），是粒径分析的 “主流方法”。	粒径主峰集中在30-150 nm，无明显大于 200 nm 的杂峰（排除微囊泡）； 粒径分布均匀，变异系数（CV）通常 < 30%（避免多分散性过高）； 可同时验证浓度合理性（如细胞上清来源外泌体浓度通常为 10⁹-10¹¹ 颗粒 /mL）。
动态光散射（DLS）	基于颗粒对光的散射强度波动，计算平均粒径和分散度，适合初步筛查（分辨率低于 NTA）。	平均粒径在 30-150 nm 范围内； 分散指数（PDI）<0.5（PDI 越小，粒径分布越均一，PDI>0.7 提示存在大量杂质）。
原子力显微镜（AFM）	利用探针扫描样本表面，获得三维形貌和粒径数据，可同时观察形态和尺寸（分辨率高，但检测效率低）。	单个囊泡高度（粒径）为 30-150 nm； 形态呈圆形，高度与直径比例符合双层膜囊泡特征（约 1:3-1:5）。

3. 特异性标志物：外泌体来源相关蛋白（分子证据）

    外泌体携带其来源细胞内体膜的特异性蛋白（“阳性标志物”），同时缺乏其他细胞器或细胞碎片的蛋白（“阴性标志物”），通过Western Blot、流式细胞术等方法检测标志物，可验证其 “外泌体身份” 并排除污染。

标志物类型	典型蛋白举例	检测意义
阳性标志物（必检）	四跨膜蛋白家族：CD9、CD63、CD81（外泌体最核心的通用标志物，源于内体膜，几乎所有外泌体均表达）； 内体相关蛋白：TSG101（内体分选复合物组件）、Alix（内体膜连接蛋白）； 细胞来源特异性蛋白：如上皮细胞来源外泌体可能表达 EpCAM，免疫细胞来源可能表达 CD45。	证明样本中存在外泌体，且来源于细胞内体系统（而非细胞膜脱落的微囊泡）。
阴性标志物（必检）	细胞器蛋白：Calnexin（内质网蛋白）、GRP94（内质网蛋白）、Cytochrome C（线粒体蛋白）； 细胞碎片蛋白：Albumin（白蛋白，血清来源杂质）、Lamin A/C（细胞核蛋白）。	排除内质网、线粒体、细胞核碎片或血清杂质污染，证明外泌体纯度。

二、补充鉴定指标：纯度分析（排除干扰）

    若外泌体用于功能研究（如药物递送、细胞通讯）或临床应用，需进一步分析纯度，避免杂质（如游离蛋白、脂蛋白、核酸）影响实验结果。常见检测方法包括：

    蛋白定量与SDS-PAGE：

        用 BCA/Bradford 法测定外泌体样本的总蛋白浓度，结合 NTA 测得的颗粒浓度，计算 “颗粒 / 蛋白比”（理想值 > 10⁹ 颗粒 /μg 蛋白，比值越低提示游离蛋白越多）；

        通过 SDS-PAGE 电泳观察蛋白条带，外泌体样本应呈现特异性条带（如 CD9、CD63），而非弥散的杂带（游离蛋白特征）。

    核酸污染检测：

        提取外泌体样本中的核酸（DNA/RNA），用琼脂糖凝胶电泳或 QPCR 检测，若出现明显的基因组 DNA 条带（如 28S/18S rRNA），提示存在细胞碎片污染。

    脂蛋白去除验证：

        外泌体与脂蛋白（如 HDL、LDL）粒径重叠（30-100 nm），可通过密度梯度离心（如蔗糖密度梯度，外泌体密度约 1.13-1.19 g/mL）分离后，检测脂蛋白标志物（如 ApoA1），验证其去除效果。

 

三、鉴定流程与注意事项

    标准鉴定流程：

    遵循 “形态→粒径→标志物” 的顺序，即：先用 TEM 观察双层膜结构，再用 NTA 确定粒径范围，最后通过 Western Blot 检测阳性 / 阴性标志物，三者均符合标准即可确认外泌体。

    关键注意事项：

        样本制备影响结果：外泌体分离方法（如超速离心、PEG 沉淀、试剂盒提取）会影响纯度，需在鉴定时注明分离方法（如 “超速离心纯化的外泌体”）；

        避免假阳性/假阴性：

            Western Blot 检测标志物时，需设置阳性对照（如已知外泌体样本）和阴性对照（如细胞裂解液）；

            NTA 检测时需稀释样本至合适浓度（10⁸-10⁹ 颗粒 /mL），避免浓度过高导致颗粒团聚，误判为大粒径杂质；
        遵循MISEV指南：发表研究时需明确列出所用鉴定方法、仪器型号及关键参数（如 TEM 放大倍数、NTA 检测温度），确保结果可重复。

 

    外泌体鉴定需 “形态、粒径、标志物” 三者结合，缺一不可，同时根据研究需求补充纯度分析，才能确保样本的真实性和可靠性，为后续功能研究或应用奠定基础。