在酵母单杂交实验中，菌株污染噬菌体是影响实验结果的严重问题，需从污染确认、紧急处理、根源排查、后续预防四个维度系统应对，以最大程度减少损失并避免污染扩散，具体操作如下：

一、第一步：精准确认污染类型，排除干扰因素

    首先需通过实验验证是否为噬菌体污染（避免误判为细菌、霉菌污染），核心判断依据如下：

1、形态与培养特征观察

    酵母液体培养基（如YPD）中，若出现浑浊度突然下降、菌体大量裂解（培养液变澄清，底部有少量絮状沉淀） ，而非细菌污染的 “持续浑浊” 或霉菌污染的 “菌丝 / 菌斑”，需高度怀疑噬菌体污染。

    固体培养基（YPD 平板）上，若酵母单菌落周围出现透明的 “噬菌斑”（圆形、边缘清晰，直径 0.5-2mm） ，且噬菌斑随培养时间扩大（2-3 天内明显），可初步判定为噬菌体污染（噬菌体裂解酵母后形成的空斑）。

2、分子生物学验证（可选，精准确认）

    取污染培养液 10000rpm 离心 10min，取上清（去除酵母菌体），用噬菌体 DNA 提取试剂盒提取核酸，以噬菌体保守基因（如衣壳蛋白基因、DNA 聚合酶基因）为引物进行 PCR 扩增（通用引物可参考酵母噬菌体（如 φ 酵母噬菌体）文献设计），若扩增出目标条带，可确诊为噬菌体污染。

 

二、第二步：紧急处理污染样本与环境，阻断扩散

    确认污染后需立即处理，避免噬菌体扩散至其他实验材料（如感受态细胞、质粒、培养基）：

1、污染样本的彻底灭活

    所有污染的酵母菌株、培养液、接种工具（移液器吸头、涂布棒、EP 管）需单独收集，采用121℃高压蒸汽灭菌 30min（噬菌体对高温敏感，高压灭菌可完全灭活），不可直接丢弃或与其他实验废物混合。

    若污染涉及固体平板，需先将平板密封（用 parafilm 包裹），再进行高压灭菌，避免灭菌过程中噬菌体气溶胶扩散。

 

2、实验环境与器具的消毒

    超净工作台 / 生物安全柜：关闭紫外灯，用10% 次氯酸钠溶液（或 0.5% 过氧乙酸）擦拭台面、侧壁、风口，作用 15-20min 后，开启通风 30min；再用 75% 乙醇二次擦拭，最后开启紫外灯照射 30min（杀灭残留噬菌体）。

    移液器、离心机等设备：若接触过污染样本，需用 75% 乙醇擦拭表面，可拆卸部件（如移液器吸头架）需高压灭菌或用次氯酸钠浸泡 20min 后清洗。

    培养基与试剂：未开封的试剂需远离污染区域；已开封但未接触污染样本的培养基，需重新灭菌后使用；怀疑被污染的试剂（如无菌水、抗生素）需直接丢弃，不可再利用。

 

三、第三步：追溯污染根源，避免再次发生

    酵母单杂交实验中，噬菌体污染多源于 “外源引入” 或 “环境交叉污染”，需重点排查以下环节：

1、菌株来源与保存

    若实验用酵母菌株（如 Y1HGold）为外购，需确认供应商是否提供 “无噬菌体污染证明”；若为实验室传代保存，需检查冻存管是否密封完好，解冻过程是否在无菌环境中操作（避免空气或操作工具带入噬菌体）。

    警惕 “菌株交叉污染”：若实验室同时培养其他微生物（如大肠杆菌、其他酵母菌株），需单独存放，操作时更换移液器吸头和手套，避免噬菌体通过气溶胶或工具转移。

2、实验操作流程

    关键操作（如酵母转化、涂板、挑单菌落）是否在超净工作台内进行？工作台是否定期清洁（建议每周用次氯酸钠彻底消毒 1 次），且紫外灯功能正常（需定期检测紫外强度）？

    是否存在 “操作不规范”：如移液器吸头反复使用、未戴无菌手套操作、样本开盖后长时间暴露在空气中、污染样本与未污染样本在同一区域操作（无隔离）等。

3、环境与耗材

    实验室空气是否流通？若周围环境存在噬菌体污染（如其他实验室使用过噬菌体），需加强通风或使用空气净化器。

    耗材（如培养皿、吸头、EP 管）是否为无菌包装？开封后是否在有效期内使用？若耗材储存环境潮湿或有灰尘，可能滋生噬菌体或其他微生物。

 

四、第四步：重启实验的注意事项

    污染处理后重启实验，需从 “材料准备、操作规范、过程监控” 三方面降低风险：

1、重新准备无菌材料

    酵母菌株：优先使用未开封的新菌株，或从可靠来源（如正规生物公司）重新购买，解冻后先在 YPD 平板上划线培养（30℃培养 2-3 天），观察是否有噬菌斑，确认无污染后再用于实验。

    培养基与试剂：所有培养基（YPD、SD/-Leu等）、抗生素（如AbA）、无菌水均需重新配制并严格灭菌（121℃，30min），灭菌后取样 100μL 涂布空白 YPD 平板（30℃培养3天），确认无菌落或噬菌斑后再使用。

    耗材：全部使用新的无菌耗材，避免使用污染处理后回收的耗材。

2、强化无菌操作意识

    实验前：超净工作台需先通风10min，再用 75% 乙醇擦拭台面，开启紫外灯照射 30min；操作人员需更换无菌实验服、手套，避免手部接触样本或耗材。

    实验中：每一步操作（如加样、涂板）需快速准确，样本开盖后立即操作，避免长时间暴露；污染风险较高的步骤（如酵母转化后涂板）需单独进行，操作后立即清理台面，并用次氯酸钠消毒。

    实验后：所有用过的耗材（即使未污染）需分类处理（可回收的高压灭菌，不可回收的密封后丢弃），超净工作台需再次消毒，记录实验过程（便于后续追溯问题）。

3、实时监控污染情况

    培养过程中，每天观察酵母生长状态：液体培养基是否清澈（无裂解），固体平板是否有异常噬菌斑或杂菌菌落。

    若需传代培养，每次挑单菌落后，需保留1-2个备份平板（30℃培养），观察 2-3 天确认无污染后，再进行后续实验（如文库筛选、自激活检测），避免因早期污染未发现导致后续实验全部失败。

 

    酵母单杂交实验中噬菌体污染的应对核心是 “快速确认、彻底灭活、追溯根源、严格预防”。一旦发现污染，需第一时间阻断扩散，避免污染范围扩大；后续实验需严格遵守无菌操作规范，从源头控制风险，确保实验结果的准确性和可靠性。若污染反复发生，可考虑使用 “无噬菌体污染的专用酵母菌株” 或在实验前对所有材料进行 “噬菌体检测”（如噬菌斑检测法），进一步降低污染概率。