在体外转录（IVT）合成RNA的过程中，由于酶促反应的非特异性、模板残留或反应条件波动，常会产生双链RNA（dsRNA）、截短RNA、DNA模板残留、核苷酸二聚体/多聚体等杂质，其中dsRNA是最受关注的免疫原性杂质。以下将分别介绍这些杂质（重点为dsRNA）的检测方法，以及杂质引发免疫反应的核心机制：

一、体外转录RNA产物中常见杂质的检测方法

1.核心杂质：双链RNA（dsRNA）的检测

    dsRNA的检测需结合“定性确认”和“定量分析”，常用方法如下：

    免疫印迹法（WesternBlot-baseddetection）：利用特异性识别dsRNA的单克隆抗体（如J2抗体、K1抗体，可特异性结合≥40bp的dsRNA），通过免疫印迹检测RNA样本中的dsRNA。操作时需将RNA样本变性后转移至膜上（或直接点样），与dsRNA抗体孵育后显影，根据条带或斑点的有无/强度判断dsRNA是否存在及相对含量。该方法特异性高，可排除单链RNA的干扰，是检测dsRNA的经典手段。

    酶联免疫吸附法（ELISA）：将RNA样本包被在酶标板上，加入dsRNA特异性抗体（如J2），再通过二抗偶联的酶（如HRP）催化底物显色，通过吸光度值定量dsRNA含量。该方法灵敏度高（可检测pg级dsRNA）、通量高，适合批量样本的定量分析，常用于RNA药物（如mRNA疫苗）的质量控制。

    琼脂糖凝胶电泳结合核酸染色法：利用dsRNA与单链RNA（ssRNA）的电泳迁移率差异（相同分子量下，dsRNA迁移速度通常慢于ssRNA），将RNA样本进行非变性琼脂糖凝胶电泳，随后用可区分dsRNA与ssRNA的染料（如SYBRGold，对dsRNA的染色亮度高于ssRNA）染色，通过凝胶成像观察是否存在异常条带（即dsRNA）。该方法操作简便、成本低，适合初步筛查，但灵敏度较低（仅能检测ng级dsRNA），且无法准确定量。

    RT-PCR法（针对特定dsRNA序列）：若已知可能产生的dsRNA序列（如由模板反向重复序列形成的dsRNA），可设计针对dsRNA的特异性引物（如分别识别dsRNA两条链的引物），通过RT-PCR扩增目标片段，根据扩增产物的有无和量判断dsRNA的存在及含量。该方法特异性极高，但仅适用于已知序列的dsRNA检测，通用性较差。

 

2.其他常见杂质的检测

    DNA模板残留：常用实时荧光定量PCR（qPCR）检测，通过设计针对体外转录模板DNA的特异性引物和探针，定量残留的DNA含量，避免DNA引发的免疫反应或对后续实验（如细胞转染）的干扰。

    截短RNA与核苷酸多聚体：可通过尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE不适用核酸，需用尿素变性胶）分离不同长度的RNA，结合银染或荧光染色观察是否存在短于目标RNA的条带（截短RNA）或小分子条带（核苷酸多聚体）；也可通过高效液相色谱（HPLC）或毛细管电泳（CE）进行定量分析，分辨率更高。

二、杂质（尤其是dsRNA）引发免疫反应的核心机制

    体外转录RNA中的杂质（主要是dsRNA，其次是未修饰核苷酸、DNA残留）会被哺乳动物细胞的固有免疫识别受体识别，激活固有免疫通路，引发炎症反应或免疫细胞活化，具体机制如下：

1.dsRNA：固有免疫的核心“危险信号”

    dsRNA在自然界中主要存在于病毒复制过程中（如RNA病毒的复制中间体、双链RNA病毒的基因组），因此人体进化出了多种专门识别dsRNA的受体，将其视为“病毒入侵的信号”，进而激活免疫反应。这些受体按分布位置可分为两类：

细胞内受体（主要通路）：

    RIG-I样受体（RLRs）：包括RIG-I、MDA5等，主要分布在细胞质中。其中，MDA5可特异性识别长链dsRNA（通常>1000bp），RIG-I则识别带有5'三磷酸基团的短链dsRNA（常见于体外转录RNA的末端杂质）。当dsRNA与RLRs结合后，会激活下游的MAVS信号分子，进而激活IRF3/IRF7和NF-κB通路，最终促使细胞分泌I型干扰素（IFN-α/β）和促炎细胞因子（如TNF-α、IL-6）。I型干扰素会进一步诱导周围细胞表达抗病毒蛋白（如PKR、OAS），同时激活NK细胞和T细胞，引发广谱的免疫反应。

    TLR3：主要分布在内涵体膜上，可识别内涵体中吞噬的dsRNA（如细胞吞噬的外源RNA颗粒）。TLR3与dsRNA结合后，会激活TRIF信号通路，同样导致I型干扰素和促炎细胞因子的释放，加剧免疫反应。

    细胞表面受体：部分细胞（如树突状细胞、巨噬细胞）表面的TLR7/8也可间接识别dsRNA的降解产物（如单链RNA片段），辅助激活免疫反应。

    这些免疫反应在生理状态下是对抗病毒的保护机制，但在体外转录RNA的应用场景中（如mRNA疫苗、基因治疗），若dsRNA杂质过多，会导致“过度免疫反应”——轻则引发局部炎症（如注射部位红肿、发热），重则可能导致全身炎症反应综合征，甚至影响RNA的稳定性（I型干扰素诱导的PKR会降解外源RNA），降低RNA的功能效率。

 

2.其他杂质的免疫激活作用

    DNA模板残留：细胞内的DNA识别受体（如cGAS-STING通路）可识别外源DNA，激活与dsRNA类似的IRF3和NF-κB通路，同样分泌I型干扰素和促炎细胞因子，加剧免疫反应；此外，DNA还可能整合到宿主基因组中，存在潜在安全风险。

    未修饰核苷酸与截短RNA：体外转录常用的未修饰尿苷（U）会被细胞内的TLR7/8识别（TLR7/8可识别含尿苷的单链RNA），激活免疫反应；而截短RNA可能形成异常的二级结构（如局部双链），间接被RLRs或TLR3识别，进一步增强免疫激活效应。

    体外转录RNA的杂质检测（尤其是dsRNA）是保障其应用安全性和有效性的关键步骤，而杂质引发的免疫反应本质是人体固有免疫系统对“外源核酸异常信号”的正常防御，需通过优化转录工艺（如使用修饰核苷酸、优化酶体系）和纯化步骤（如柱纯化去除dsRNA、DNA酶消化去除模板）来降低杂质含量，减少免疫干扰。