高通量筛选用siRNA库的合成通常采用哪种技术路线?如何平衡合成成本与库容量?
高通量筛选用siRNA库的合成通常采用化学合成法、体外转录法和酶消化法等技术路线,以下是具体介绍:
化学合成法:通过固相合成的方式,在固体支持物上利用磷酸酰胺酯法或H-膦酸酯法,使核苷酸与特定试剂之间发生化学反应,形成磷酸二酯键,逐步构建RNA链。该方法能提供大量均一、纯净的siRNA产品,适用于大规模制备和商业化生产,但合成成本较高。
体外转录法:利用RNA聚合酶的催化作用,以DNA为模板在体外合成RNA。常用T7和SP6RNA聚合酶,它们能识别并结合到DNA模板上的特定启动子区域启动合成。该方法成本相对较低,生产速度快,但规模扩大的可能性有限。
酶消化法:先准备双链RNA(dsRNA)作为底物,然后利用核酸内切酶,如Dicer酶或Ago2酶,对dsRNA进行切割,生成21-23个核苷酸长度的siRNA片段。该方法能高效、特异地生成大量siRNA片段,但产物纯度和特异性可能受酶活性和底物质量的影响。
要平衡合成成本与库容量,可以考虑以下策略:
选择合适的合成方法:对于大规模的siRNA库,体外转录法成本较低,可先采用体外转录法进行初步筛选,找到有效的siRNA序列后,再用化学合成法进行大量合成,以保证质量和满足后续实验需求。
优化设计算法:使用高效的siRNA设计算法,如Ambion的合作伙伴CenixBioScience开发的设计算法,可提高预测强效和特定siRNA序列的成功率,减少需要检测的序列数量,从而降低成本。
采用新的合成技术:如酶合成技术中的生物催化融合成策略,像Almac的3-2-3-2混合拼接策略BOOST平台,结合了酶促催化与化学合成的优势,可提高合成效率,减少杂质,降低成本,同时适用于大规模siRNA生产。
合理规划库容量:根据实验目的和预算,合理确定siRNA库的规模。不是盲目追求最大的库容量,而是确保库中的siRNA能够覆盖关键的基因靶点和功能区域。对于一些已知功能较为相似的基因家族,可以适当减少每个基因的siRNA数量,避免不必要的成本浪费。
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