在双荧光素酶报告基因实验（双荧光实验）中，动物细胞与植物细胞的核心原理一致——通过报告基因（如萤火虫荧光素酶Luc） 检测目标调控元件（如启动子、 enhancer、miRNA靶位点）的活性，同时以内参基因（如海肾荧光素酶Rluc） 校正转染效率差异。但由于动植物细胞的结构（如细胞壁、细胞器）、转染方式及培养体系存在本质区别，操作步骤的核心差异集中在细胞准备、转染方法、孵育条件和裂解处理四个环节，具体区别如下：

一、核心区别总览表

操作环节	动物细胞（以哺乳动物细胞为例）	植物细胞（以烟草叶片细胞为例）
1.细胞准备	无细胞壁，贴壁/悬浮培养，需控制细胞密度（如60%-80%汇合度）	有细胞壁，需通过“原生质体制备”去除壁或直接用完整叶片浸润
2.转染方法	脂质体转染、病毒转染、电穿孔（无需去壁）	农杆菌介导浸润（最常用）、原生质体脂质体转染、基因枪
3.转染后孵育	37℃、5%CO₂恒温培养箱，孵育24-48h	22-25℃、光照培养（模拟自然生长条件），孵育24-72h
4.细胞裂解	直接加动物细胞专用裂解液，裂解5-10min	需先研磨破碎细胞壁（液氮/研磨仪），再加植物专用裂解液
5.其他关键差异	无需考虑光照、渗透压；转染效率较高（20%-80%）	需严格控制渗透压（原生质体易破裂）、光照影响基因表达； 转染效率较低（10%-50%）

二、分步骤详细操作差异

1. 细胞准备阶段：细胞壁与培养体系的核心差异

    双荧光实验的前提是让报告基因载体进入细胞，而植物细胞的细胞壁（纤维素、果胶构成） 是载体进入的主要障碍，因此两者的细胞准备方式完全不同。

环节	动物细胞（如HEK293T、Hela）	植物细胞（如烟草N.benthamiana、拟南芥）
细胞来源	细胞系（冻存复苏后传代）或原代细胞（如心肌细胞）	完整植株叶片（最常用，无需离体培养）或原生质体（离体酶解制备）
关键处理	贴壁细胞：转染前1天铺板，确保转染时汇合度60%-80%（避免过度生长）； 悬浮细胞：转染时密度调整为1×10⁶3×10⁶cells/mL	完整叶片：提前1-2天培育健康叶片（无病虫害，叶龄3-4周）； 原生质体：用纤维素酶+果胶酶裂解叶片细胞，去除细胞壁，需在等渗缓冲液（如含甘露醇）中操作，避免细胞破裂
培养条件	DMEM/RPMI等培养基+10%胎牛血清（FBS）+双抗（青霉素/链霉素），37℃、5%CO₂	完整植株：土壤/水培，22-25℃，16h光照/8h黑暗周期； 原生质体：MS培养基（无琼脂）+蔗糖，25℃避光培养（避免光损伤）

 

2. 转染/转化阶段：载体导入方式的本质差异

    动物细胞无细胞壁，可通过脂质体等化学方法直接介导载体进入；植物细胞因细胞壁阻碍，需依赖农杆菌介导（利用细菌天然侵染植物的特性）或物理方法（基因枪、电穿孔） 。

方法	动物细胞常用方法	植物细胞常用方法
1.脂质体转染（最常用）	原理：脂质体与DNA形成复合物，通过细胞膜融合进入细胞； 操作：将报告载体（Luc）、内参载体（Rluc）与脂质体混合，室温孵育20min后滴加至细胞培养板； 适用：贴壁/悬浮细胞（如HEK293T转染效率高）	仅适用于原生质体（无细胞壁）； 注意：需使用植物原生质体专用脂质体（如Lipofectamine3000适配型），避免渗透压损伤； 不适用：完整叶片细胞（细胞壁阻挡脂质体复合物）
2.农杆菌介导（植物特有）	不适用（农杆菌无法侵染动物细胞）	原理：将报告基因插入农杆菌Ti质粒，农杆菌通过叶片伤口侵染植物细胞，将目的基因整合到植物基因组或瞬时表达； 操作： 1.农杆菌转化：将Luc/Rluc载体转入农杆菌（如GV3101）； 2.浸润处理：用含农杆菌的缓冲液（含乙酰丁香酮，诱导Ti质粒表达）浸泡叶片10-30s，或注射到叶片表皮下； 适用：完整叶片（瞬时表达，操作简单，无需离体培养）
3.其他方法	病毒转染（慢病毒/腺病毒，适用于难转染细胞）、电穿孔（适用于悬浮细胞）	基因枪（适用于单子叶植物，如水稻，通过高压将DNA包裹的金颗粒打入细胞）、电穿孔（仅适用于原生质体）

 

3. 转染后孵育阶段：环境条件的差异（温度、光照、CO₂）

    动植物细胞的生理代谢需求不同，孵育条件直接影响报告基因的表达效率。

条件	动物细胞	植物细胞
温度	37℃（哺乳动物体温，匹配细胞代谢速率）	22-25℃（植物最适生长温度，过高/过低抑制基因表达）
CO₂	5%CO₂（维持培养基pH稳定，如DMEM含NaHCO₃）	无需CO₂（植物通过光合作用/呼吸作用调节自身pH，培养基无需CO₂缓冲）
光照	无需光照（多数动物细胞避光培养，避免光毒性）	16h光照/8h黑暗周期（模拟自然生长，光照可调控部分植物启动子（如光响应基因）的活性，需根据实验目的调整）
孵育时间	24-48h（报告基因表达达峰，过长易导致细胞凋亡）	24-72h（植物细胞代谢较慢，且农杆菌介导的表达需要更长时间；原生质体孵育不超过48h，避免破裂）

 

4. 细胞裂解阶段：细胞壁破碎的关键步骤

    动物细胞无细胞壁，可直接用裂解液溶解细胞膜；植物细胞需先破坏细胞壁，再裂解细胞膜，否则无法释放荧光素酶蛋白。

步骤	动物细胞	植物细胞
预处理	弃培养基，用PBS洗1-2次（去除血清残留，避免干扰裂解）	完整叶片：剪下浸润后的叶片，用滤纸吸干表面液体，剪成小块（约0.5cm×0.5cm）； 原生质体：离心收集细胞（1000rpm，5min），弃上清，用PBS洗1次
破碎细胞壁	无需（无细胞壁）	必须步骤： 1.液氮研磨：将叶片小块放入研钵，加液氮快速研磨至粉末状（避免反复冻融，保护酶活性）； 2.研磨仪破碎：用组织研磨仪（加钢珠）在4℃下破碎，效率更高
裂解操作	加入动物专用裂解液（如Promega的PLB），室温摇床孵育5-10min，裂解后离心（12000rpm，5min）取上清	向研磨后的粉末中加入植物专用裂解液（含蛋白酶抑制剂，避免酶降解），4℃摇床孵育15-20min（充分裂解细胞膜），离心（12000rpm，10min）取上清（去除细胞壁碎片）
关键注意事项	裂解液避免过量，确保裂解液与细胞比例合适（如6孔板每孔加200μLPLB）	研磨时需彻底（否则裂解不充分，蛋白得率低）；裂解液需预冷（4℃），避免高温导致荧光素酶失活

 

5. 荧光检测与数据分析：步骤基本一致

    两者的检测原理和数据分析方法完全相同，均通过双荧光素酶检测仪（Luminometer）实现：

    加底物检测：取裂解上清，先加萤火虫荧光素酶底物，检测 Luc 活性（报告信号）；再加终止液（含海肾荧光素酶底物），检测 Rluc 活性（内参信号）。

    数据校正：计算相对荧光活性=Luc活性/Rluc 活性（消除转染效率、裂解效率的差异）。

    结果分析：比较不同处理组（如对照组 vs 疾病模型组）的相对荧光活性，判断目标调控元件的活性变化。

 

三、核心差异的本质原因

    动植物双荧光实验的操作区别，本质是由细胞结构（细胞壁有无） 和生理特性（代谢温度、光照需求） 决定的：

    动物细胞：无壁、异养、需 37℃/CO₂，操作核心是 “高效转染+快速裂解”；

    植物细胞：有壁、自养、需常温/光照，操作核心是 “突破细胞壁障碍（农杆菌 /研磨）+模拟自然生长条件”。

    实验设计时需根据细胞类型选择适配的转染方法、裂解方案和孵育条件，才能确保报告基因的有效表达和检测准确性。