实时定量聚合酶链反应（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR）是一种高灵敏度、高特异性的分子生物学技术，可以实现对目标DNA或cDNA序列在体外进行扩增和定量。其操作简单、分析速度快，适用于基因表达的相对定量、差异表达等研究。下面将详细介绍qPCR的原理和流程。

一、qPCR原理

    qPCR是一种通过荧光定量来检测PCR产物量的方法。实现qPCR主要依靠荧光探针或SYBR Green染料。其中荧光探针具有更好的特异性，但需要选取目标序列上下游设计探针；而SYBR Green染料则是一种非特异性染色剂，可以染色所有双链DNA，适合于生信数据分析较困难的情况。

    qPCR的核心思想就是通过利用PCR反应过程中的指数级增殖，将微量模板DNA或cDNA扩增到可以被荧光检测的数量级，并且实时监测扩增过程。

    PCR最开始的循环阶段，温度一般在50~60℃，以引物与模板DNA的匹配为起点，反转录酶过程中产生的DNA链偏移原有链而形成的双链结构，此时相邻的碱基可以通过高速扩增过程，催化最左侧恰好匹配的引物结合匹配模板另外一条链上，这样在每个循环过程中这种配对就会因指数级扩增而导致PCR产物越来越多。

二、qPCR实验步骤

1、设计引物和荧光探针

    qPCR实验前需要准备一对引物，即荧光标记的前向引物和荧光标记的反向引物，以及荧光探针。一般情况下，前向引物和反向引物之间的目标序列长度应该在100 bp以内。引物序列应当避免酶切位点（如EcoRI、BamHI等）和不稳定区域（如AT区），同时还要尽可能地选取目标区域（如编码区、保守区、外显子区），避免选择多态性或重复序列区域。荧光探针是特异性染色剂，也需要根据体系中的需求选择不同类型的探针。

2、制备qPCR反应体系

    制备qPCR反应体系需要包括基本的成分，如DNA模板、引物、荧光探针、酶以及缓冲液等。根据不同的需求，qPCR反应体系可以进行调整。

3、调整实验参数

    在开始正式进行qPCR实验之前，需要对实验参数进行调整。通常包括PCR扩增温度、延迟时间和荧光检测时间等。

4、运行qPCR实验

    在调整好实验参数后就可以运行qPCR实验了。一般情况下，每次运行都会进行多个循环，以便引物与模板DNA充分匹配。实时检测荧光信号产生的大小并将其记录下来。

5、数据分析

    数据分析是qPCR实验的最后一个步骤。处理数据的方法有很多种，其中最简单的是使用文献中的比较阈值Ct法（cycle threshold），常用于相对定量分析。另外，还可以使用其他分析工具如REST、DELTACt等，来对数据进行更加准确、有效的分析。

    qPCR技术已经成为了现代分子生物学研究中必不可少的技术之一。只要准备充分，操作得当，就可以通过qPCR实验来获取丰富的数据，并且为相关科学研究或者临床诊断提供有力的支持。