在mRNA合成（包括体外转录合成和体内合成）中，5’帽结构和3’poly(A)尾的添加方式及对mRNA稳定性的作用如下：

一、5’帽结构的添加方式

     mRNA的5’帽是m⁷GpppN（7-甲基鸟嘌呤三磷酸核苷）结构，其添加分为两步，体外转录与体内合成的流程略有差异：

1、体内合成（细胞内）

     转录起始后，新生的mRNA5’端为三磷酸鸟苷（pppN），首先由鸟苷酸转移酶催化，将一分子GTP的焦磷酸基团与mRNA的5’端三磷酸基团连接，形成5’-5’三磷酸桥键（pppG-pppN）。

     随后由甲基转移酶催化，将S-腺苷甲硫氨酸（SAM）上的甲基转移到鸟嘌呤的7位氮原子上，形成m⁷GpppN，即核心的0型帽；部分真核mRNA还会进一步在相邻核苷酸的2’-羟基上甲基化，形成1型帽或2型帽。

 

2、体外转录合成（mRNA疫苗/基因治疗用）

     有两种常用方法：共转录加帽和转录后加帽。

     共转录加帽：在转录体系中直接加入帽类似物（如m⁷GpppG），T7/T3RNA聚合酶会优先识别帽类似物作为转录起始位点，直接合成带5’帽的mRNA，操作简便且效率高。

     转录后加帽：先合成无帽的mRNA，再通过牛痘病毒加帽酶复合物（包含鸟苷酸转移酶和甲基转移酶），分步完成加帽和甲基化修饰，适合对帽结构特异性要求高的场景。

二、3’poly(A)尾的添加方式
     3’poly(A)尾是一段由数十至数百个腺嘌呤核苷酸组成的序列，添加方式也分体内和体外两类：

1、体内合成（细胞内）

     mRNA转录终止后，由剪切和聚腺苷酸化特异性因子（CPSF）识别mRNA3’端的AAUAAA信号序列，招募剪切因子切割mRNA。

     随后poly(A)聚合酶（PAP）结合到切割后的mRNA3’端，以ATP为底物，不依赖模板合成poly(A)尾；poly(A)结合蛋白（PABP）会结合到新生的poly(A)尾上，调控尾的长度并保护其不被降解。

 

2、体外转录合成

     主要有两种策略：模板编码法和酶法加尾。

     模板编码法：在体外转录的DNA模板3’端设计一段多聚T序列，转录后直接生成带poly(A)尾的mRNA，尾长由模板的T序列长度决定，稳定性好。

     酶法加尾：先合成不含poly(A)尾的mRNA，再用大肠杆菌poly(A)聚合酶催化，以ATP为底物在mRNA3’端添加poly(A)尾，可灵活调控尾长。

 

三、5’帽结构和3’poly(A)尾对mRNA稳定性的作用

     这两种结构是维持mRNA稳定、防止其被降解的核心元件，协同发挥作用：

1、5’帽结构的稳定作用

     直接阻断5’→3’外切核酸酶的降解作用，因为5’帽的5’-5’反向连接方式改变了mRNA的末端结构，使外切酶无法识别和切割。

     帽结构可结合帽结合蛋白（eIF4E），该蛋白不仅参与翻译起始，还能招募相关因子形成保护复合物，进一步增强mRNA的稳定性。

 

2、3’poly(A)尾的稳定作用

     poly(A)尾可结合poly(A)结合蛋白（PABP），PABP能阻止3’→5’外切核酸酶的攻击，避免mRNA从3’端被逐步降解。

     PABP还可与结合在5’帽上的eIF4E相互作用，使mRNA形成环状结构，既提升翻译效率，又减少两端暴露于核酸酶的概率，双重增强稳定性。

 

3、协同效应

     5’帽结合蛋白与3’PABP的相互作用形成的环状mRNA结构，是维持mRNA稳定性的关键：一旦其中一个结构缺失，另一个结构的保护作用会大幅减弱，mRNA会被快速降解。