分析荧光素酶发光信号强度与蛋白相互作用的关系，需基于 “信号强度与蛋白相互作用的亲和力/稳定性正相关” 的核心逻辑，结合实验设计、信号校正及定量分析实现，具体步骤如下：

一、明确实验系统的 “信号 - 互作” 关联原理

    常用实验系统为荧光素酶互补技术（Split-luciferase）：将荧光素酶拆分为无活性的 N 端（Nluc）和 C 端（Cluc）片段，分别与待研究的两个蛋白（靶蛋白 X、互作候选蛋白 Y）融合表达（即 X-Nluc、Cluc-Y）。

若 X 与 Y 发生相互作用，会通过空间 proximity 带动 Nluc 与 Cluc 重组为活性荧光素酶，催化底物（如腔肠素）发光 ——发光信号越强（以相对发光单位 RLU 衡量），说明 X 与 Y 的结合能力越强或结合稳定性越高。

二、通过对照实验排除 “非互作干扰信号”

    需设置 3 类对照以区分 “特异性互作信号” 与背景（如蛋白自发折叠、非特异性结合）：

    阴性对照：用无互作的 “无关蛋白” 替换 X 或 Y（如 X-Nluc+Cluc-GFP、GFP-Nluc+Cluc-Y），其 RLU 代表 “非特异性背景信号”（若靶蛋白有突变体，可设 “结合位点突变型 X-Nluc+Cluc-Y”，互作消失则信号应接近阴性对照）；

    阳性对照：用已知强互作的蛋白对（如已验证的 A-B 复合物，构建 A-Nluc+Cluc-B），其 RLU 作为 “有效互作信号” 的参考基准；

    空白对照：仅加荧光素酶底物和缓冲液，排除底物自发发光、仪器背景的干扰（需从所有样本中扣除）。

三、信号检测与 “标准化校正”（核心步骤）

    直接检测的 RLU 可能受 “蛋白表达量差异”“转染效率波动” 等因素干扰，需通过标准化消除非互作相关变量：

    基础信号定量：用化学发光酶标仪检测样本（X-Nluc+Cluc-Y）及对照的 RLU，先减去 “空白对照 RLU”，得到 “净信号”；

    校正 “蛋白表达量差异”：

        若 X、Y 融合蛋白的表达量不同（如转染效率低导致某组 X-Nluc 表达少），会直接降低潜在重组的荧光素酶量，导致信号偏误。需通过 Western blot 检测 X-Nluc、Cluc-Y 的表达量，或在实验中共转 “内参荧光素酶”（如海肾荧光素酶 Rluc）——用 “样本净信号（X-Y 互作）÷ 内参 Rluc 信号” 得到 “归一化信号”，消除表达量 / 转染效率的影响；

    重复验证：至少 3 次独立实验（每次 3-5 个复孔），取平均值 ± 标准差，保证数据可靠性。

四、通过定量分析建立 “信号 - 互作强度” 关联

    基于标准化信号，从 3 个维度分析：

    “信号 / 背景比” 判断是否存在互作：若样本归一化信号 ÷ 阴性对照归一化信号≥3（通常阈值），可判定 X 与 Y 存在特异性相互作用；

    信号强度直接反映互作强弱：对比不同组的归一化信号（如野生型 X-Y vs 突变型 X-Y），信号越高则互作越强（例：野生型信号为 2000RLU，突变型为 300RLU，说明突变削弱了互作）；

    剂量效应/竞争实验验证特异性：若增加Y的表达量（或 X 的表达量），X-Y 的发光信号呈梯度升高（剂量效应）；或加入 “游离未标记 X”（竞争结合 Y），信号随游离 X 浓度升高而降低，可进一步证明信号与 X-Y 互作的直接关联。

核心是通过 “对照排除背景”“标准化消除变量”，让发光信号的差异仅由 “蛋白相互作用的强弱” 决定 —— 最终通过信号强度的定量比较，直接反映蛋白互作的亲和力或稳定性。