在分子生物学、生物化学和细胞信号转导等领域的研究文献中，免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）实验是揭示蛋白质-蛋白质相互作用最经典和广泛使用的实验技术之一。其核心原理是利用特异性抗体将目标蛋白（诱饵蛋白，Bait）及其相互作用的伴侣蛋白（猎物蛋白，Prey）从复杂的细胞裂解液中“拉下来”（免疫沉淀，IP），随后通过SDS-PAGE分离沉淀物中的蛋白质，再使用针对不同靶蛋白的抗体进行WB检测，从而直观地展示出哪些蛋白质之间存在特异性结合。

    理解Co-IP实验的结果图对于正确解读文献结论至关重要。 这些图像不仅仅是实验成功的证明，更是揭示蛋白质间潜在功能联系、复合物组装或信号通路调控的直接证据。对于初次接触或经验尚浅的小伙伴而言，Co-IP结果图中包含的多条泳道和各种对照会让人很头痛。 接下来就给大家详细讲解如何看懂Co-IP实验结果图?

    在看图之前，我们先了解清楚实验设计中设置的关键对照组及其代表的生物学和技术含义！！！

IP（Immunoprecipitation）泳道： 

    这是实验的核心泳道，代表使用特异性抗体（抗诱饵蛋白抗体）进行免疫沉淀后得到的复合物。在WB膜上，如果用抗诱饵蛋白的抗体检测此泳道，能看到强烈的信号（证明IP成功捕获了诱饵蛋白）；如果用抗猎物蛋白的抗体检测此泳道，观察到的信号则可能表明猎物蛋白与诱饵蛋白存在相互作用。

注意：仅凭这一条泳道无法下结论，因为存在非特异性结合的可能性，要看下对照组的结果。

IgG 泳道：

    这是阴性对照。该泳道模拟了实验操作过程中可能发生的非特异性结合。在WB检测时，猎物蛋白在IgG泳道应该几乎没有信号或信号非常微弱。只有当“IP-猎物”泳道的信号显著强于“IgG-猎物”泳道的信号时，才能更有把握地认为观察到的相互作用是特异的，而非实验假象。

Input 泳道：（全细胞裂解液）/ Total Lysate

    这是阳性对照，它代表在进行免疫沉淀之前，取出的一小部分未经任何处理的细胞总裂解液。该泳道展示了实验开始时细胞中所有目标蛋白（诱饵蛋白和猎物蛋白）的总量和表达水平。

    解读时需注意：确认诱饵蛋白和猎物蛋白在Input中均有表达（排除因蛋白不表达导致的假阴性）。

标签-蛋白：

    如HA-蛋白A，表明蛋白A和标签蛋白HA串联，用HA抗体进行IP相当于对A蛋白的IP，一般使用标签因为没有A蛋白的抗体，或A的抗体不好用。

    常见标签有Flag→肽序列DYKDDDDK；c-Myc→肽序列EQKLISEEDL；HA→肽序列YPYDVPDYA；绿色荧光蛋白(GFP)等。

案例分析1：

我们先来看下实验中经常看到的原始WB图

   ❖一次完整严谨的Co-IP实验，应当包含IgG对照组、IP实验组以及Input组；

   ❖Input泳道所点样本与IP前WB一致，作为阳性对照；

   ❖判定Co-IP实验成功的标准，是能够在IP泳道检测到诱饵蛋白信号，且IgG泳道检测不到；如果IgG泳道也检测到诱饵蛋白，说明该蛋白能够与所有IgG类的抗体结合，只能换别的实验如酵母杂交、GST pulldown等来验证。

   ❖在IP后能够检测到诱饵蛋白的前提下，如果检测不到猎物蛋白，说明两个蛋白不互作，至少在这个样本和实验体系下不互作，并不代表实验本身有问题；

   ❖Co-IP后往往会在IgG和IP泳道出现目的条带以外的杂带，这是由于Co-IP实验会往实验体系中加入抗体进行富集，这些抗体最终也会也会被WB的二抗识别到；

抗体轻链重链问题：

   抗体由轻链和重链构成，轻链分子量约为25KD，重链分子量约为50-70KD，如上图所示，由于使用了识别轻链的二抗，因此IgG和IP泳道均在25KD左右出现了抗体链条带；在做IP后WB时，为了避免抗体链对结果的干扰，应灵活选择二抗。

案例分析2

案例分析3

针对加入标签蛋白的Co-IP结果图进行解析

图源：An NLR paralog Pit2 generated from tandem duplication of Pit1 fine-tunes Pit1 localization and function

   在解读中，我们需要结合实验的具体设计（如处理条件、不同细胞系/组织、不同抗体组合等）以及图像中信号强度的定量分析（如果提供），才能对蛋白质相互作用的真实性、强度以及潜在生物学意义做出更全面和准确的评估，如果大家碰到更复杂的图，也不要着急，基本都是换汤不换药，我们只要按照文献的描述，仔细理解就行，原理都是一样的！