RNA Pull Down与RIP(RNA免疫沉淀)的区别是什么?
RNA Pull Down和 RIP(RNA免疫沉淀)有以下区别:
1、实验原理:
RNA Pull Down:是一种体外实验方法。先将目标RNA序列进行修饰,如生物素化或标记,然后与细胞裂解产物或核酸提取物孵育,形成RNA-蛋白质复合物。接着通过亲和层析,利用固相支持物(如磁珠或琼脂糖树脂)捕获该复合物,经洗涤去除非特异性结合物质,最终得到RNA及其结合蛋白质的复合物。
RIP:是一种体内实验方法。利用特异性抗体针对目标RNA结合蛋白,将细胞裂解并准备细胞提取物后,添加抗体与RNA所结合的蛋白质形成免疫复合物,再通过免疫沉淀步骤将 RNA - 蛋白质复合物捕获在固相支持物上,洗涤后通过酶解或其他方法从复合物中提取 RNA 和蛋白质。
2、实验目的:
RNA Pull Down:主要用于鉴定和研究RNA与特定蛋白质的相互作用关系,可发现新的RNA结合蛋白质,侧重于在体外确定RNA与蛋白质之间是否存在直接相互作用以及鉴定相互作用的蛋白质。
RIP:旨在研究细胞内特定RNA与蛋白质间的相互作用,用于确认已知的RNA结合蛋白质在体内与哪些RNA结合,或发现新的与特定RNA相互作用的蛋白质,更强调在细胞内生理状态下研究RNA-蛋白质的相互作用。
3、实验操作:
RNA Pull Down:操作相对简单,主要包括RNA探针标记、与细胞提取物孵育、复合物捕获和洗涤、分析等步骤。不需要进行细胞交联等复杂操作,但需要制备高质量的RNA探针和优化孵育条件等。
RIP:实验步骤较为复杂。通常需要先对细胞或组织样本进行交联,以稳定RNA和蛋白质的相互作用,然后进行细胞裂解、抗体孵育、免疫复合物沉淀、洗涤、去交联以及RNA和蛋白质的提取等多个步骤,每个步骤都需要严格控制条件以保证实验结果的准确性。
4、实验材料:
RNA Pull Down:需要标记的RNA探针、细胞裂解液或核酸提取物、固相支持物(如链亲和素标记的磁珠)等。
RIP:需要细胞或组织样本、针对目标蛋白的特异性抗体、蛋白质 A/G 磁珠或其他用于免疫沉淀的材料、交联剂等。
5、结果分析:
RNA Pull Down:得到的复合物可通过Western blotting检测已知的 RNA 结合蛋白是否与目标RNA相互作用,也可通过质谱分析鉴定与RNA结合的未知蛋白质,还可以通过下一代测序等技术分析与RNA相互作用的蛋白质的编码基因等。
RIP:通过RT-qPCR可定量分析免疫沉淀复合物中特定RNA的富集情况,确定其与目标蛋白的结合程度;通过高通量测序(RIP-seq)可全面分析与目标蛋白相互作用的RNA谱,发现新的RNA靶标。
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