PKH26是一种脂溶性的荧光染料，能与细胞膜的脂质分子稳定地结合，从而标记活细胞的膜结构。在细胞分裂时，PKH26荧光会平均分配到两个子代细胞中，因此荧光强度会随着分裂次数而递减。PKH26标记的细胞具有高稳定性和低毒性，适用于体外和体内长期示踪实验。

应用方向

PKH26染色可用于多种细胞生物学研究，主要有以下几个方面：

  细胞增殖分析：通过测量细胞的荧光强度和分布，可以估算细胞的增殖代次、增殖速率、增殖周期等参数。这种方法可以用于检测不同条件下细胞的增殖能力，如抗原刺激、药物干预、基因修饰等。也可以用于识别不同增殖能力的细胞亚群，如干细胞、祖细胞、癌细胞等。

  细胞迁移分化跟踪：通过将标记的细胞移植到体内或体外的目标组织中，可以观察细胞在活体组织中的迁移轨迹和分化状态。这种方法可以用于研究干细胞治疗、组织再生、肿瘤转移等过程。

  细胞间相互作用检测：通过观察不同荧光标记的细胞之间的接触、融合、转移等现象，可以研究细胞间的信号传递、功能协调、物质交换等机制。这种方法可以用于研究免疫反应、血小板功能、病毒感染、纳米颗粒摄取等过程。

 

实验流程及注意事项：

      PKH26染色包含PKH26试剂溶解和稀释、细胞悬液制备和染色、染色后细胞洗涤和重悬、荧光检测和分析等实验步骤，具体流程如下：

 

       PKH26试剂溶解和稀释

  从冰箱中取出PKH26试剂，静置几分钟至室温，或者37℃水浴片刻后，离心盛放PKH26的管子，开盖前请务必离心几分钟让试剂充分落入管底后才能开盖。（注意：PKH26试剂为DMSO溶液，在低温时会凝固，需要加热融解后使用。）

  根据需要检测的细胞样品数，用合适的溶液（如：无血清培养基，HBSS或PBS）将PKH26母液250-500倍稀释，配制成染色工作液。（注意：最佳的工作液浓度请根据不同细胞和自身的实验体系来调整；PKH26易被水解，在水溶液中会很快变质，所以工作液要现配现用，不能提前配。）

 

  细胞悬液制备和染色

  将制备好的待测细胞用100-200μL染色工作液重悬，至细胞浓度大约1×10⁷Cells/mL。注意：对于贴壁细胞，可直接就贴壁状态的细胞进行荧光标记，进行原位染色；染色液足够覆盖细胞即可。

  将染色液和细胞在37℃培养箱中孵育5-15分钟。（注意：孵育时间根据细胞种类和染色效果而定。）

  在2-8℃培养箱中孵育15-30分钟。（注意：这一步是为了让染料与脂质分子形成稳定的结合。）

 

  染色后细胞洗涤和重悬

  离心后去上清，收集细胞，用PBS洗涤细胞1-2次，最后加入含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞。（注意：洗涤是为了去除未结合的染料，减少荧光背景。）

  根据自己实验需要处理细胞。（注意：标记后的细胞可以用于细胞增殖、迁移、分化等研究，也可以用于体外和体内的示踪实验。）

 

  荧光检测和分析

  取500μL细胞悬液，用流式细胞仪检测。荧光波长：λex=551nm,λem=567nm。注意：流式细胞仪可以检测细胞的荧光强度和分布，以及细胞增殖代次等参数。

  随后还可按照细胞的正常培养方法进行培养。（注意：标记后的细胞也可以在荧光显微镜下直接观察标记效果。）

 

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